Novo saznanje o ponašanju SO₂ u vinu

Ko će bolje i proučiti i dati na uvid svoja naučna dostignuća, ako ne, američki časopis za vino i vinovu lozu AJEV (American Journal of Enology and Viticulture).

Zato ga toplo preporučujem kolegama vinarima i vinskim entuzijastima. U ovom članku vas vodim kroz najnovija otkrića o ponašanju SO₂ u vinu. Uživajte!

U nastavku knjige Understanding Wine Chemistry (Razumevanje hemije vina) autora A. Waterhousea, G. Sacksa i D. Jefferyja, podsećamo se da je “vino mešavina stotina različitih molekula u stalnom stanju fluksa, osobine koja mu daje kvalitet žive stvari koja diše.” Interakcija sulfita sa drugim jedinjenjima u vinu služi kao glavni primer ove ideje.

Naše razumevanje ove teme podvrgnuto je radikalnoj reevaluaciji u 21. veku, a poruka koju možemo poneti kući mogla bi biti “nije tako jednostavno kao što smo nekad mislili.”

Ovaj članak sadrži materijal koji bi čitaocu laiku mogao biti izazovan, no urednici su ga ipak odlučili štampati u nelektorisanom obliku. Ambiciozni čitaoci ovde će pronaći materijal koji dramatično unapređuje njihovo znanje o važnom aspektu modernog vinarstva. — Peter Bell

VINARI RUTINSKI DODAVAJU sumpor dioksid (SO₂) kao konzervans. Od mnogih uloga SO₂, njegovu jedinstvenu sposobnost da ograniči pojavu oksidisanih aroma i tamnjenje u vinu bila je jedna od najtežih za nadomestiti.

Nedavni rad našeg tima i drugih pružio je bolje razumevanje uloge SO₂ u redoks reakcijama, kao i nove prilike za istraživanje kako bi se sprečila pojava oksidisanog karaktera uz ograničavanje upotrebe SO₂.

Oblici SO₂ u vinu – Terminologija

SLIKA 1. Sažetak različitih frakcija SO₂.

Među vinarima, SO₂ (često se naziva “sulfit”) koristi se kao opšti izraz za sumporni dioksid (opor gas) i jedan od nekoliko povezanih oblika koji nastaju nakon dodavanja SO₂ vinu ili soku.

Vinari dodaju SO₂ vinu u obliku soli poput kalijum metabisulfita, ili u njegovom gasovitom obliku iz čeličnih boca, ili u koncentrisanim vodenim rastvorima napravljenim iz oba izvora, obično u koncentracijama od 1 do 6 posto rastvorenog SO₂.

• Svojstva konzervisanja rastvorenog SO₂ prvenstveno se pripisuju slobodnom SO₂, koji se sastoji od zbira neutralnog, tzv. molekulskog SO₂ oblika i njegove odgovarajuće baze, bisulfita (HSO^3-)_. Ova dva oblika postoje u brzoj ravnoteži.

Pri pH vina (3,0 do 4,0), bisulfit daje glavni doprinos slobodnom SO₂ (više od 95%), sa višim udelima uočenim pri višem pH.

• Bisulfit je primarni oblik odgovoran za antienzimsko i antioksidativno delovanje SO₂. Vinari obično ciljaju 20 do 40 mg/L slobodnog SO₂ u čuvanim ili pakovanim vinima kako bi ograničili neželjene reakcije oksidacije i/ili otpuštanje vezanih mirisa sa oksidisanim aromama.

• Antimikrobna aktivnost pripisuje se molekulskom obliku SO₂, a vinari uopšte teže da imaju 0,4 do 1,0 mg/L molekulskog SO₂ kako bi sprečili aktivnost mikroba. Viša vrednost obično se koristi za slatka vina sa većim rizikom od refermentacije.

Kao što je gore spomenuto, udeo slobodnog SO₂ koji postoji kao molekulski SO₂ raste sa padom pH, tako da se dva oblika (molekulski i slobodni SO₂) moraju razmatrati odvojeno.

• Deo bisulfita će reverzibilno formirati komplekse (vezani SO₂) sa nizom komponenti vina. Jedinjenja SO₂ u vinu uključuju acetaldehid koji se jače veže (aroma „oraha, natučene jabuke”), kao i slabije komplekse uključujući druge aldehide „oksidisanog” mirisa (npr. metional).

Ostala jedinjenja koja se reverzibilno vežu, ali imaju malo ili nimalo arome uključuju šećere u slatkim vinima (glukoza i u manjoj meri fruktoza), antocijanine (u crvenim vinima) i druga karbonska jedinjenja mikrobnog porekla poput piruvata (metabolizam kvasca) i glukuronske kiseline (iz trulog grožđa).

• Frakcije vezanog i slobodnog SO₂ su u ravnoteži, tako da dok se slobodni SO₂ troši u reakcijama oksidacije, vezani SO₂ disosuje kako bi se održala ravnoteža između skupova.
Za razliku od gotovo trenutne ravnoteže molekulskog SO₂ i bisulfita, ravnoteža slobodnih i vezanih jedinjenja SO₂ zahteva sate ili dane.

• Zbir vezanog i slobodnog SO₂ naziva se ukupnim SO₂, što je oblik SO₂ regulisan u SAD-u na 350ppm i (ograničenje = bela vina 200ppm, crna vina 150ppm) u Evropi.

Nova saznanja: Slobodni SO₂ i oksidacija vina

Radovi tokom poslednjih dveju decenija pokazali su da je antioksidativni oblik SO₂ bisulfit i da njegova uloga nije direktna reakcija sa kiseonikom, već reakcija sa produktima oksidacije vina. Identifikovana  su dva puta oksidacije vina, “gvožđe-fenolni” put i “bakar-sulfhidrilni put”, od kojih se čini da je gvožđe-fenolni put glavni put odgovoran za potrošnju kiseonika. Šema tog puta prikazan je na SLICI 2.

SLIKA 2. Pregled “gvožđe-fenolnog” oksidacionog puta.

Bisulfit ograničava pojavu oksidativnih promena u vinu (posmeđivanje, stvaranje aldehida, gubitak tiola) reakcijom sa početnim oksidacijskim produktima (vodoonik peroksid, hinoni).

Ključni koraci u putu gvožđe-fenol su:

• Kiseonik brzo reaguje sa redukovanim oblikom gvožđa (Fe²⁺ ) stvarajući njegov oksidisani oblik (Fe³⁺ ) i vodoonik peroksid. Fe³⁺ zatim oksidiše fenolna jedinjenja da proizvede hinone, i tako se vraća natrag u Fe²⁺. Gvožđe je stoga važan oksidacioni katalizator jer kruži između svoja dva oblika, omogućujući kiseoniku da deluje kao oksidans.

• Hinoni mogu proći kroz nekoliko reakcija, uključujući stvaranje kompleksa sa poželjnim tiolima poput 3-sulfanilheksanola (aroma “citrusa”). Međutim, bisulfit
brzo redukuje hinone natrag u njihov fenolni oblik i sprečava njihovo sudelovanje u drugim reakcijama oksidacije vina.

• H₂O₂ može proći kroz “Fentonovu reakciju” u prisustvu Fe⁺² da proizvede hidroksilne (·OH) slobodne radikale. Ovi slobodni radikali mogu lako oksidisati alkohole kako bi stvorili jedinjenja sa oksidisanim aromama ili koji doprinose tamnjenju. Na primer, oksidacija etanola Fentonovom reakcijom rezultira stvaranjem acetaldehida (aroma “natučene jabuke”).

Bisulfit stoga može sprečiti manifestaciju “oksidacije” i “oksidisanih” svojstava (gubitak poželjnih mirisa, stvaranje neugodnih mirisa i tamnjenje) u vinu putem tri metode:

1) Bisulfit će potrošiti H₂O₂ i hinone kako bi sprečio njihovu daljnju reakciju sa komponentama vina.
2) Brza reakcija H₂O₂ i hinona pomoću bisulfita ubrzava potrošnju kiseonika u vinu, što bi zauzvrat trebalo ograničiti sudelovanje kiseonika u drugim reakcijama (npr. „bakar-sulfhidrilni” put, koji će rezultirati gubitkom tiola.
3) Bisulfit se takođe može vezati sa aldehidima aktivnim na miris i drugim oksidacionim produktima dajući oblike bez mirisa.

Nakon gubitka slobodnog bisulfita, vezani SO₂ oblici će disosovati kako bi se delimično obnovio bisulfit i ponovno uspostavila ravnoteža.
Teoretski, očekuje se da će odnos ukupnog gubitka SO₂ i potrošnje O₂ biti 2:1 na molarnoj osnovi ako bisulfit u potpunosti reaguje sa H₂O₂ i hinonom i ne nastaju nova jedinjenja. To odgovara odnosu 4:1 ako se pretvori u miligrame po litri bisulfita prema rastvorenom kiseoniku.

SLIKA 3.

Opcija A – Fentonova reakcija mogla bi generisati nove aldehide iz gvožđem katalizovane oksidacije alkohola pomoću H₂O₂. Ti bi aldehidi nastali hemijskom oksidacijom.

Opcija B – Nakon gubitka bisulfita, vezani SO₂ disosuje i oslobađa slobodne aldehide, poput onih nastalih tokom fermentacije. Ti aldehidi su već postojali, ali bi sada bili neugodnog mirisa zbog disocijacije i zbog gubitka SO₂ iz vina!
 
Dve mogućnosti za proizvodnju slobodnih aldehida nakon oksidacije preko železno-fenolnog puta.

U opciji A, vodoonik peroksid nastao oksidacijom vina prolazi kroz Fentonovu reakciju dajući slobodne radikale, koji potom reaguju sa alkoholima poput etanola dajući aldehide.
U opciji B, aldehidi su u početku prisutni u vezanim oblicima, a oslobađaju se nakon potrošnje slobodnog SO₂ i ponovnog uspostavljanja ravnoteže vezanih i slobodnih oblika.
 
Šta je važnije tokom tipične oksidacije vina, Fentonova reakcija koja stvara nove aldehide ili gubitak bisulfita koji otkriva postojeće aldehide?
Nedavni rad na modelnim vinskim sistemima sa tipičnim koncentracijama Fe za vino objavio je da se Fentonova reakcija i stvaranje acetaldehida mogu pojaviti čak i u prisutnosti 0,6 mM (38 mg/L) slobodnog SO₂.

Nasuprot tome, rad na pravim vinima izvestio je o malo dokaza o Fenton reakciji kao izvoru aldehida tokom oksidacije čak i pri zanemarljivim koncentracijama SO₂, na temelju nedostatka korelacije između povećanja aldehida i odgovarajućih alkohola.

Međutim, ova posljednja studija i mnoge druge o oksidaciji vina uključivale su uslove nestacionarnog stanja u kojima je vino zasićeno kiseonikom (~8 mg/L, zavisno od temperature i drugih činioca).

Ovi uslovi su  prikladniji za procenu promena u markerima oksidacije (npr. gubitak ukupnog ili slobodnog SO₂; posmeđivanje; povećanje slobodnih aldehida), ali možda neće omogućiti ravnotežu slobodnih i vezanih bazena SO₂ kao što bi se dogodilo tokom dugotrajnog skladištenja.

U većini pakovanih vina, brzina ulaska kiseonika je spora u poređenju sa brzinom potrošnje kiseonika, tako da komercijalna vina obično postižu „stacionarno stanje” s vrlo niskim koncentracijama rastvorenog O₂ (manje od 1 mg/L).

Prirodni eksperiment za procenu oksidacije u “stacionarnom stanju”: Ogledi skladištenja u vrećici u kutiji

Naš tim je  imao pristup komercijalnom ispitivanju koje je uključivalo tri vina (Merlot, Chardonnay i Cabernet Sauvignon) čuvana u različitim materijalima za pakovanje bag-in-box (BiB) na sobnoj ili povišenoj temperaturi do 400 dana.
Visoke stope prenosa kiseonika (OTR) nekih vrsta BiB pakovanja mogu omogućiti gotovo potpunu oksidaciju SO₂ u jednoj godini ili manje.
U ovom eksperimentu, ukupni i slobodni SO₂ meren je tokom skladištenja, a kiseonik je meren na početku i na kraju skladištenja za neka vina. Reprezentativni podaci o SO₂ za vino Chardonnay prikazani su na SLICI 4, levo.

SLIKA 4.

SLIKA 4. Y-odsečak = 50mg/l jako vezani SO₂ (acetaldehid-bisulfit). Različite vrste simbola = različito BiB pakovanje.
Stopa prenosa kiseonika i ukupni gubitak SO₂ zavise od uslova skladištenja.

Udeo slobodnog i ukupnog SO₂ ne zavisi od brzine oksidacije ili temperature. Nema dokaza o stvaranju novih kompleksnih jedinjenja sa SO₂ (nema Fentonove reakcije)
 
SLIKA 4. (levo) Ukupni SO₂ u odnosu na vreme skladištenja u vinu Chardonnay smeštenom u različitim BiB pakovanjima na sobnoj i povišenoj temperaturi; (desno). Ukupni SO₂ u odnosu na količine slobodnog SO₂ za BiB tretmane skladištenja vina. Radnje prilagođene iz (Sacks et al. 2020).

Ukupna stopa gubitka SO₂ varirala je od 0,13 do 0,91 ukupnog SO₂ mg/d/L kao funkcija vrste pakovanja i temperature skladištenja. Najbrže stope potrošnje SO₂ uočene su pri povišenim temperaturama (zatvoreni simboli), verovatno zbog bržeg prenosa kiseonika. OTR (Oxygen Transfer Rate = Brzina prenosa kiseonika)

Pod pretpostavkom da će sav kiseonik koji ulazi u pakovanje nedirektno potrošiti ukupni SO₂ u molarnom odnosu 2:1, te vrednosti odgovaraju brzinama prenosa kiseonika (OTR) od 0,03 do 0,26 O₂ mg /d/L, ili oko 10 do 1000 puta više od OTR-ova prijavljenih za staklenu ambalažu. Međutim, OTR su bili dovoljno niski tako da su koncentracije kiseonika u stabilnom stanju ispod zasićenja, slično vinima u staklenim pakovanjima.

Otkrovenje

Konstantan ukupni gubitak SO₂ čak i sa nemerljivim slobodnim SO₂ ukazuje na zanemarljivu Fentonovu reakciju i oslobađanje i slabo i jako vezanog SO₂.

Prvobitno smo pretpostavili da bi Fentonova reakcija* trebala postati sve važnija kako se oksidacija vina odvija i slobodni SO₂ (uglavnom slobodni bisulfit) približava nuli.

Pod tim uslovima, acetaldehid i drugi aldehidi bi se akumulirali, a gubitak ukupnog SO₂ trebao bi se usporiti (SLIKA 5. levo). Umesto toga, posmatrali smo konstantne stope ukupnog gubitka SO₂ čak i nakon što je slobodni SO₂ bio nemerljiv (reprezentativni podaci za Chardonnay čuvan na 31°C prikazani su na SLICI 5. desno).

* Fentonova reakcija definisana je kao proces koji uključuje stvaranje hidroksilnih radikala pomoću fero gvožđa (Fe²⁺) i vodoonik peroksida, koji se obično koriste za razgradnju novonastalih kontaminanata u vodi.

SLIKA 5.

Hipotetički, ukupni i slobodni SO₂ u odnosu na vreme skladištenja ako se nova vezivanja SO₂ generišu tokom oksidacije; (desno) Opaženi ukupni i slobodni SO₂ tokom vremena za reprezentativno vino Chardonnay. Podaci preuzeti iz (Sacks et al. 2020).

Iz ovih podataka o vinima iz stvarnog sveta izvlačimo sljedeće zaključke:

• Za brzu reakciju sa H₂O₂ i sprečavanje Fentonove reakcije potrebni su samo tragovi slobodnog SO₂. Za Chardonnay, posmatramo linearnu stopu ukupnog gubitka SO₂ za ukupne koncentracije SO₂ od samo 10 mg/L (SLIKA 4, levo).

Pod pretpostavkom da sav SO₂ postoji kao acetaldehid-bisulfit u ovom trenutku, očekivana koncentracija slobodnog SO₂ je ~1 mg/L na temelju literaturne konstante vezivanja za acetaldehid-bisulfit. Ova koncentracija je ispod uobičajenih analitičkih granica detekcije za slobodni SO₂, ali očito još uvek dovoljna da spreči Fentonovu reakciju u ovim vinima.

• Brzina disocijacije vezanog SO₂ brža je od brzine ulaska kiseonika, čak i za jako vezane komplekse acetaldehid-bisulfita ili komplekse antocijanin-bisulfita u crvenim, pa čak i u pakovanjima sa visokim OTR-om kao što je BiB.

Svi vezani oblici SO₂ u ravnoteži su sa slobodnim SO₂ i na kraju će se potrošiti kroz reakcije oksidacije – čak i bisulfit koji je vezan za acetaldehid, koji se u nekim publikacijama pogrešno naziva “nepovratno vezan”.

Daljnji dokazi o nedostatku udela Fentona bez reakcije i ukupnog SO₂ ne zavise od brzine oksidacije ili temperature skladištenja. Dodatni uvid može se dobiti crtanjem ukupnog SO₂ u odnosu na slobodni SO₂ za isto vino u svim uslovima skladištenja (kombinacije pakovanja i temperature).

Podaci su prikazani za Chardonnay na SLICI 4. desno, a slični rezultati su viđeni i za ostala vina (Merlot, Cabernet Sauvignon). Sve parcele imaju tri uočljiva područja.

• Prvo područje je linearno i proteže se preko slobodnog SO₂ raspona od 5 do 50 mg/L. Nagib linije je približno 1,4 za Chardonnay, što znači da smanjenje ukupnog SO₂ od 1,4 mg/L rezultira samo.

Smanjenje slobodnog SO₂ od 1 mg/L jer će se deo slabo vezanog SO₂ disosovati i delimično obnoviti slobodni SO₂. Veći nagibi (1,8 do 2,1) uočeni su za crna vina, što ukazuje da imaju veću koncentraciju slabo vezanih jedinjenja.

• Drugo područje presreće i prolazi duž y-ose. U ovoj fazi vino sadrži merljivi ukupni SO₂, ali ne i detektabilni slobodni SO₂. U ovom području može se pretpostaviti da se vezana frakcija SO₂ gotovo u potpunosti sastoji od čvrsto vezanog acetaldehid-bisulfita.

Y-odsečak (50 mg/L za Chardonnay prikazan na SLICI 4. desno) trebao bi biti proporcionalan ukupnoj koncentraciji acetaldehida, koju izračunavamo na 34 mg/L na temelju molarnog odnosa 1:1.

• Prva dva područja povezana su nelinearnim područjem pri slobodnom SO₂ = 2 do 5 mg/L.

Zanimljivo je da se krivulje za sve postupke skladištenja određenog vina preklapaju, što ukazuje da udeo slobodnog i ukupnog SO₂ ne varira sa temperaturom skladištenja ili brzinom oksidacije.

Ako se događa Fentonova reakcija, očekivali bismo da reakcija (i istodobno stvaranje aldehida) pokazuje temperaturnu zavisnost, a udeo ukupnog naspram slobodnog SO₂ trebao bi zavisiti od uslova skladištenja.

Temperaturna nezavisnost udela ukupnog naspram slobodnog SO₂ dodatno podupire naš zaključak da je Fentonova reakcija od male važnosti u pravim vinskim sistemima, čak i nakon što se slobodni SO₂ više ne može otkriti.

Praktične implikacije za vinara

Zašto je važno da su vaši aldehidi “otkriveni”, a ne “formirani”?

Na kraju našeg istraživanja, BiB vina sa koncentracijama slobodnog SO₂ manjim od 10 mg/L mirisala su “aldehidno” i “oksidisano”.

Međutim, ponašanje ukupnog i slobodnog SO₂ tokom skladištenja sugeriše da se Fentonova reakcija nije dogodila, niti druge reakcije stvaranja aldehida poput “Streckerove razgradnje” aminokiselina u prisutnosti hinona.

Najverovatnije objašnjenje povećanja aldehidnog karaktera nakon oksidacije je oslobađanje vezanih aldehida iz vezanih oblika SO₂ (SLIKA 3. opcija B), u skladu sa opažanjima drugih autora.

Zašto bi vinara mogao zanimati ovaj zaključak da se arome aldehida u “oksidiranim” vinima otkrivaju iz prethodno postojećih sadržaja, a ne da se ponovno stvaraju tokom skladištenja? Ispod je nekoliko mogućnosti za razmatranje u vinarstvu:

1. Ako ograničimo nakupljanje snažnih aldehida poput metionala na kraju fermentacije, možemo li imati vina koja će izbegnuti miris na oksidisana čak i bez dodataka SO₂?

Mnogi od ključnih aldehida neugodnog mirisa poput metionala proizvode se metabolizmom aminokiselina (Ehrlichov put) tokom fermentacije. Ti će se aldehidi zatim vezati nakon dodavanja SO₂ na kraju fermentacije.

Uspešno smanjenje koncentracije ovih aldehida na kraju fermentacije trebalo bi rezultirati vinima koja mogu sadržavati manje slobodnog SO₂ bez mirisa oksidacije.

Dokazano je da čuvanje vina na otvorenom pre dodavanja sulfita smanjuje acetaldehid i deo je razloga za “lagerovanje”* od strane pivara. Moguće je da bi se sličan učinak mogao postići i za druge aldehide u vinu.

*„lagerovanje“ odnosno odležavanje na niskim temperaturama koje dovodi do jačanja ukusa sladovine i slabljenja bilo kakvih „čudnih“ ukusa piva.

2. Kako možemo dobiti aldehide kada ih želimo, naprimer tokom mikrooksigenacije?

U proizvodnji crnog vina, vinari će često namerno uvoditi niske do umerene količine kiseonika kako bi olakšali proizvodnju acetaldehida i srodnih jedinjenja, koja na kraju mogu reagovati sa taninima i antocijanima da daju “polimerni pigment”.

Pretpostavlja se da ovaj acetaldehid nastaje oksidacijom etanola i Fentonovom reakcijom. Ako je izvor umesto SO₂ vezani acetaldehid, trebaju li vinari pokušati povećati taj skup? Možda će takođe trebati ponovno razmotriti ranu početnu upotrebu SO₂ nakon fermentacije.

3. Može li vino mirisati oksidisano i bez kiseonika? Nedavna istraživanja pokazala su da druge komponente vina mogu konzumirati SO₂ čak i u odsutnosti kiseonika, uključujući derivate triptofana i produkte hidrolize tanina.

Ako se glavni izvor aldehida neugodnog mirisa oslobađa iz oblika vezanih za SO₂, to sugeriše da bi vino moglo izgubiti slobodni SO₂ i mirisati oksidisano čak i bez izlaganja kiseoniku.

Izvor: WBM / april 2022. / Vinarstvo
Glavno predavanje ASEV 2021:
Novi uvidi u vezani SO₂ i oksidaciju vina